Dahar Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Nembe parantos dibuktoskeun yén jamur aspék Ilyonectria crassa sanggup nginféksi umbi kentang. Karya ieu mangrupikeun anu munggaran ngaanalisis ciri biologis sareng tahan ka sababaraha fungisida tina galur I. crassa anu diisolasi tina kentang. Runutna daérah khusus spésiés tina galur "kentang" sasarengan sareng anu diala tiheula pikeun jamur diisolasi tina akar daffodil, ginseng, aspen sareng beech, bohlam bakung sareng daun tulip. Tétéla, seueur pepelakan liar sareng kebon tiasa janten cadangan tina I. crassa. Galur anu ditalungtik kaserang keureut tomat sareng kentang, tapi henteu nginféksi buah tomat sadayana sareng umbi kentang utuh. Ieu nunjukkeun yén I. crassa mangrupakeun parasit tatu. Evaluasi résistansi kana fludioxonil, difenoconazole sareng azoxystrobin dina médién gizi nunjukkeun khasiat obat-obatan ieu.
Indéks EC50 (konsentrasi fungisida, anu kalem ku 2 kali tingkat tumuhna radial koloni anu aya hubunganana sareng kontrol fungisida) sami sareng 0.4; 7.4 sareng 4 mg / l, masing-masing. Kamungkinan ngembangkeun panyakit anu disababkeun ku I. crassa kedah diperhatoskeun nalika penilaian fitopatologis umbi kentang sareng pamekaran tindakan panyalindungan pepelakan.
Ngembangkeun mikroorganisme fitopatogenik ngabalukarkeun karugian tinggi dina sadaya tahapan melak sareng nyimpen kentang. Nalika ngarencanakeun lindung, salaku aturan, patogén anu terkenal diperhatoskeun, sapertos spésiés genera Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, sareng sajabana Nanging, dina taun-taun ayeuna, beuki seueur laporan anu muncul ngeunaan munculna mikroorganisme fitopatogenik anyar dina kentang. Biologi na kirang diulik, efektivitas fungisida anu dianggo dina kentang anu teu aya hubunganana sareng kanyahoan, metode diagnostik teu acan dikembangkeun. Kalayan pangembangan anu masif, aranjeunna sanggup nyababkeun karusakan anu signifikan dina pepelakan kentang. Salah sahiji mikroorganisme ieu nyaéta jamur aspék Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, munggaran dipanggihan ku panulis dina umbi kentang (Chudinova dkk, 2019).
Karya ieu nampilkeun hasil analisis tina galur I. crassa anu diisolasi tina umbi kentang. Morfologi koloni sareng struktur misélial I. crassa, urutan nukléotida daérah khusus DNA pikeun spésiés, karacunan kana kentang sareng tomat, sareng perlawanan ka sababaraha fungisida populér diulik.
Bahan sareng métodeu
Kami nganggo galur I. crassa 18KSuPT2 diisolasi dina 2018 tina umbi kentang anu katépaan dipelak di daérah Kostroma. Umbi kapangaruhan ku jenis rot garing kalayan rongga ditutupan miselium coklat lampu. Nganggo jarum anu ngabedah steril, miselium jamur dipindahkeun kana piring Petri kalayan médium agar (bir wort 10%, agar 1.5%, pénisilin 1000 U / ml). Pelat-pelat diinkubasi dina gelap dina 24 ° C.
Mikroskop cahaya Leica DM2500 kalayan kaméra digital ICC50 HD sareng mikroskop binérika Leica M80 nganggo kaméra digital IC80HD (Leica Microsystems, Jérman) digunakeun pikeun motret, meunteun ukuran sareng morfologi spora sareng organ spora.
Pikeun ngasingkeun DNA, miselium jamur dipelak dina medium kacang polong cair, teras dibekukan dina nitrogén cair, homogenisasi, diinkubasi dina panyangga CTAB, dimurnikeun ku kloroform, sareng dikumbah dua kali ku alkohol 2%.
Metodeu ékstraksi DNA dijelaskeun sacara rinci dina tulisan ku Kutuzova dkk. (2017).
Pikeun nangtoskeun spésiésna ku metode molekular sareng ngabandingkeun sareng galur I. crassa anu dikenal, PCR dilakukeun kalayan primér anu ngamungkinkeun amplifikasi daérah DNA spésifik spésifik: ITS1-5,8S-ITS2 (primér ITS5 / ITS4, White et al., 1990), daérah gén b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) sareng tarjamahan faktor pemanjangan 1α (tef1α) (primér EF1-728F / EF1-986R, Carbone sareng Kohn, 1999). Amplicons tina panjang anu dipikahoyong sasari tina gél nganggo kit Evrogen CleanUp. Daérah anu digedekeun diruntuykeun nganggo BigDye® Terminator v3.1 Siklus Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) dina Applied Biosystems 3730 xl otomatis sequencer (Applied Biosystems, CA, USA). Urutan sekuen nukléotida anu di anggo digunakeun pikeun milarian pertandingan dina database GenBank tina Pusat Nasional AS pikeun Informasi Biotéhnologi (NCBI). Analisis filogénetik dilakukeun ngagunakeun program MEGA 6 (Tamura dkk, 2013).
Tekad kajahatan dilaksanakeun dina buah héjo tomat ageung buah (ragam Dubrava) sareng umbi kentang (ragam Gala). Salaku tambahan, pikeun simulate karuksakan bungbuahan sareng umbi anu ruksak, kami nganggo irisan tina buah sareng umbi anu sami. Irisan umbi disimpen dina kamar anu lembab, nyaéta piring Petri kalayan kertas saringan baseuh di handapeunna. Geser disimpen dina kertas, anu dina gilirannana, irisan umbi atanapi buah disimpen. Tubers sareng buah-buahan lengkep ogé disimpen dina wadah anu nganggo kertas saring baseuh di handapeun. Di tengah keureutan (atanapi dina permukaan utuh tina umbi atanapi buah), sapotong agar (5 × 5 mm) kalayan hypae jamur disimpen saatos 5 dinten tumuh dina agar-agar.
Penilaian résistansi galur jamur kana fungisida dilaksanakeun dina kaayaan laboratorium dina sedeng gizi agar. Kami diajar kerentanan kana ubar fungisida Maxim, KS (bahan aktif fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Katalog nagara ..., 2020). Évaluasi dilaksanakeun dina piring Petri dina medium wort-agar kalayan ditambihan ubar anu ditalungtik dina konsentrasi zat aktif 0.1; hiji; 1 ppm (mg / L) (pikeun fludioxonil sareng difenoconazole), 10; sapuluh; 1 ppm (pikeun azoxystrobin) sareng dina média tanpa fungisida (kontrol). Fungisida ieu ditambihan kana sedeng dilebur didinginkan nepi ka 10 ° C, satutasna sedengna dituang kana piring Petri. Blok agar kalayan miselium jamur disimpen di tengah piring Petri sareng berbudaya dina suhu 100 ° C dina poék. Saatos 60 dinten inkubasi, diaméter koloni diukur dina dua arah anu saling jejeg; hasil pangukuran pikeun tiap jajahan rata-rata. Ékspériménna dilakukeun dina triplicate. Dumasar kana hasil analisis, EC24 diitung, sami sareng konsentrasi fungisida, anu naékkeun satengahna tingkat pertumbuhan radial koloni anu aya hubunganana sareng kontrol fungisida.
Hasil sareng diskusi
Dina piring Petri kalayan agar wort, jamur ngawangun koloni sareng miselium flocculent bodas. Sedeng handapeun miselium ngancik beureum-coklat. Nalika sedeng garing, jamur ngawangun spora tina dua jinis dina konidiofor tunggal sareng agregat dina sporodochia alit. Macroconidia manjang, silinder, sareng hiji dugi ka tilu sétta, panjang rata-rata 27.2 withm kalayan kisaran nilai tina 23.2 dugi ka 32.2 m, lébar - dugi ka 4.9 µm (Gbr. 1). Panjang rata-rata mikroconidia nyaéta 14.3 µm kalayan kisaran nilai tina 10.3 dugi 18.1 µm, lébarna dugi ka 4.0 µm. Sadaya karakter makro- sareng mikromorphologis pas kana kisaran variasi spésiés Ilyonectria crassa (Cabral dkk, 2012).
Runutna daérah DNA khusus spésiés (ITS, b-tubulin, TEF 1α) saparantosna cocog sareng urutan galur I. crassa anu urang pelajari tadi (Chudinova et al., 2019, Tabel 1). Dina raraga diajar prevalénsi I. crassa di daérah sanés sareng nganalisis spéktrum budaya anu kapangaruhan, sekuen DNA anu sami dina database GenBank dianalisis (Tabel 1). Tumpang tindihna 86 dugi ka 100%. Urutan sadaya tilu daérah DNA tina "kentang" galur I. crassa idéntik sareng urutan galur anu diisolasi tina bohlam bakung sareng akar narsisus di Walanda sareng tina akar ginseng di Kanada. Kami henteu tiasa mendakan galur I. crassa sanésna sareng tilu urutan analog anu dianalisis dina basis data kabuka. Nanging, analisa susunan ITS sareng b-tubulin anu disimpen nunjukkeun ayana I. crassa dina daun tulip di Inggris. Jamur kalayan sekuen ITS anu sami dicirikeun nalika nganalisis mycobiota tina akar aspen di Kanada sareng akar beech di Italia, sareng umbi kentang di Saudi Arabia (Tabel 1). Hasil tina panilitian ieu nunjukkeun yén I. crassa gaduh sebaran global sareng sanggup ngainfeksi sababaraha jinis tutuwuhan.
Nalika nangtoskeun patogénisitas dina irisan tomat sareng kentang dina dinten ka-5, diaméter lesi ngahontal 1.5 cm. Galur anu ditalungtik henteu nginféksi buah tomat sareng ubi kentang utuh. Nanging, sepalna kapangaruhan kana tomat. Pikeun ngaluarkeun kamungkinan kontaminasi, isolat jamur tina miselium anu dikembangkeun dina irisan umbi kentang diisolasi kana budaya murni. Éta leres-leres sami sareng galur kolot. Tétéla, I. crassa mangrupakeun parasit tatu.
Pangobatan sateuacan pepelakan tubers siki sareng fungisida ngirangan pangembangan panyakit dina pepelakan nalika usum tumuh. Pikeun pamilihan fungisida anu épéktip, penting pikeun nganalisis mana waé anu épéktip ngalawan I. сrassa. Karya diulik zat aktif nyebar tina fungisida - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole. Fludioxonil dirumuskeun dina sababaraha campuran anu dianggo pikeun ganti baju siki sareng umbi siki sateuacan dipelak. Fludioxonil (Maxim) ogé dianggo pikeun ngubaran umbi siki sateuacan disimpen. Difenoconazole sareng azoxystrobin ogé kalebet kana sababaraha olahan anu dianggo pikeun ngolah bahan siki, ogé dina persiapan anu ditujukeun pikeun ngolah pepelakan vegetatif (State katalog ..., 2020).
Laju pertumbuhan I. crassa diulik dina média (Gbr. 2) kalayan konsentrasi anu béda tina zat aktip: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm), sareng difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (Tabel 2). Persiapan ieu tiasa dianggap épéktip pisan ngalawan I. crassa, kumargi EC50 na sacara signifikan langkung handap tina konsentrasi anu disiapkeun dina persiapan cairan anu dianggo pikeun ngubaran umbi. Numutkeun kana State Catalog ... (2020), konsentrasi fludioxonil dina cairan pikeun ngubaran umbi kentang nyaéta 500 dugi ka 1000 ppm, azoxystrobin (dina cairan kanggo ngarawat handapeun furrow) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (dina cairan pikeun ngubaran pepelakan vegetatif) - 187.5– 625 ppm.
Tabel 1. Kamiripan tina sekuen spésiés spésifik tina galur 18KSuPT2 sareng galur Ilyonectria crassa aya dina database Genbank
Galur | Pepelakan host, situs ékskrési | Nomer urutan disimpen dina GenBank, perséntase kamiripan | link | ||
ANAK | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 sareng 18KSuPT2 | Ubi kentang, daérah Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova dkk, 2019, jalan ieu |
BPS 158/31 | Akar Narcissus, Walanda | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral dkk., 2012 |
BPS 139/30 | Bohlam Lily, Walanda | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Akar Ginseng, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Daun tulip, Inggris | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Akar Aspen, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield dkk., 2020 |
ER1937 | Beech, Itali | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Kaluman langsung |
KAUF19 | Ubi kentang, Arab Saudi | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = henteu disimpen
Tabel 2. Résistansi Ilyonectria crassa kana fungisida
(zat aktif) | EC50, ppm | ||||
dinten 3 | dinten 5 | dinten 7 | |||
pangawasan | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
Dina padamelan urang, galur I. crassa diisolasi tina umbi kentang di daérah Kostroma sareng Moskwa (Chudinova dkk, 2019). Babandingan galur jamur anu luhur sareng sekuen ITS anu sami sareng I. crassa diturunkeun nalika nganalisis mycobiota tubers kentang di Saudi Arabia (Gashgari and Gherbawy, 2013). Tétéla, I. crassa henteu langka dina kentang siga sigana. Ékspérimén kami nunjukkeun yén jamur tiasa nginféksi buah tomat anu rusak. Dipikaterang tina literatur yén I. crassa mampuh ngembangkeun saprotrophically dina taneuh (Moll et al., 2016), ogé mangaruhan rupa-rupa pepelakan, bahkan anu jauh sacara taksonomis sapertos daffodil, lili, ginseng, aspen, sareng beech (Tabel 1). hiji). Tétéla, seueur pepelakan liar sareng kebon tiasa janten cadangan tina I. crassa. Di luhur nunjukkeun yén nalika ngembangkeun ukuran panyalindungan, perlu diperhatoskeun kamungkinan mangaruhan umbi kentang ku jamur ieu. Persiapan nyebar pikeun ngubaran umbi kentang anu ngandung fludioxonil, azoxystrobin, sareng difenoconazole parantos nunjukkeun efficacy fungicidal anu luhur ngalawan I. crassa.
Karya ieu dirojong ku Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 20-016-00139).
Tulisan ieu diterbitkeun dina jurnal "Bulletin Protection Plant", 2020, 103 (3)