D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Hortéptopogenik jamur Colletotrichum coccodes nyababkeun panyakit bahaya dina kentang sareng tomat anu katelah titik hideung antraknosa sareng umbi. Ku ciri morfologis, aranjeunna sering sesah ngabédakeun tina panyakit anu disababkeun ku mikroorganisme séjén; dina bubuahan tomat héjo, panyakitna tiasa teu asimtomatik, ngan ukur dina buah beureum anu asak. Pikeun diagnosis gancang sareng akurat tina patogén, sistem tés PCR real-time ditawarkeun. Pikeun ngembangkeun sistem uji, sekuen nukléotida glikérol trifosfat gén dehidrogenase 45 C. galur coccodes diisolasi tina umbi kentang di daérah anu béda-béda di Rusia ditangtoskeun.
Dumasar kana hasil anu diala sareng analisa sekuen anu sami pikeun spésiés sanés anu aya dina database GenBank, spésipér spésipér spésifik sareng panyilidikan pikeun C. coccodes didesain. Pikeun mariksa kekhususan sistem tés anu diciptakeun, PCR dilumangsungkeun sareng DNA diisolasi tina budaya murni tina 15 spésiés béda jamur parasit sareng saprotrofik anu aya hubunganana sareng tomat sareng tutuwuhan kentang (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Ayana DNA Coccodes Colletotrichum ditangtukeun dina siklus bangbarung 20-27, sedengkeun spésiés anu sanés dideteksi saatos 40 siklus atanapi henteu dideteksi. Sistem tés ngamungkinkeun pikeun ngadeteksi C. konsentrasi DNA konsentrasi DNA langkung saé tina 0.01 ng / mm3 dina campuran PCR anu dianalisis. Ngagunakeun sistem uji anu dikembangkeun, ayana C. coccodes dina daun tomat kalayan gejala panyakit jamur sareng umbi kentang tanpa gejala éksternal panyakit ditalungtik. Daun kalayan gejala inféksi jamur dikumpulkeun tina dua bidang anu béda di Wewengkon Krasnodar, umbi - ti sawah di daérah Kostroma, Moskow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Hiji daun tomat anu ngandung C. coccodes DNA kapanggih di Téritori Krasnodar; ayana signifikan DNA patogén ieu kauninga dina 5 sampel tubers anu dipelak di daérah Kostroma, Moskow, Kaluga.
perkenalan
Suung tina genus Colletotrichum mangrupikeun fitopatogén bahaya anu mangaruhan séréal, sayuran, bumbu, buah perennial sareng tutuwuhan berry. Salah sahiji spésiés dimana-mana tina genus ieu, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, mangrupikeun agén panyabab antraknosa sareng titik hideung kentang sareng tomat, sareng nyababkeun panyakit sajumlah pepelakan sanés kulawarga Solanaceae, kalebet. rebun-rebun (Dillard, 1992). C. coccodes mangaruhan sadaya bagian jero bumi tina pepelakan, basa bobot, daun, sareng buah (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Dina mesék umbi kentang anu kainféksi, pangembangan bintik kulawu kalayan sisina anu teu jelas dibaca dititénan, anu titik-titik hideung sporulasi sareng microsclerotia jelas katingali. Nalika disimpen, maag sareng eusi lemes tiasa ngabentuk dina pulp tubers, nyaéta panyakit asup kana fase antraknosa, anu kitu, jarang pisan.
Dina waktos anu sasarengan, gejala antraknosis (maag kulit sareng titik-titik hideung alit) khas tina buah tomat. Dina daun, gejala C. coccodes muncul salaku bintik coklat poék, biasana dibatesan ku jaringan konéng (Johnson, 1994).
Ngembangkeun titik hideung dina umbi ngarusak penampilanana, anu khusus diucapkeun nalika ngajual kentang beureum-mesék dikumbah. Ékspoliasi mesék nyababkeun kaleuleusan éapan sareng ningkatna karugian panyimpenan (Lapar, McIntyre, 1979). Karuksakan organ tutuwuhan sanés nyababkeun ngahasilkeun karugian, anu nyatet dina taneuh terbuka sareng taneuh tertutup (Johnson, 1994; Tsror dkk, 1999). Panyakit anu disababkeun ku C. coccodes umum di ampir sadaya daérah ngahasilkeun kentang di dunya, kalebet Rusia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Kontrol panyakit ieu sesah kusabab teu cekap efektivitas fungisida anu aya ngalawan C. coccodes sareng henteuna variétas tahan (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes tiasa bertahan dina umbi siki (Read, Hide, 1988; Johnson dkk., 1997), siki tomat (Ben-Daniel dkk, 2010), salamet lami dina taneuh, dina pepelakan pepelakan (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) sareng dina gulma (Raid, Pennypacker, 1987). Karya sajumlah panulis (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) nunjukkeun yén kamekaran panyakit dina kentang sareng tomat kalolobaanana gumantung kana ayana inokulum dina siki sareng taneuh. Ku alatan éta, pikeun ngaminimalkeun karugian tina panyakit, perlu didiagnosis (kalebet kuantitatif) anu nyebarkeun jamur dina bahan siki, dina taneuh, dina umbi kentang siki sareng siki tomat anu disimpen kanggo disimpen. Diagnostik morfologis dina taneuh sareng bahan pepelakan tiasa dilaksanakeun ngan ukur ku ayana microsclerotia, anu, ogé, ogé aya dina jinis jamur anu sanés.
Gejala dina umbi mirip pisan sareng budug perak anu disababkeun ku jamur Helminthosporium solani. Ngasingkeun koccode Colletotrichum sareng Helminthosporium solani kana budaya murni rada sesah sareng peryogi lami kusabab tumuh lalaunan dina medium gizi. Pikeun gancang ngaidentipikasi coccodes Colletotrichum, perlu ngagunakeun metode diagnostik instrumental. Metodeu anu paling merenah nyaéta réaksi ranté polimérase (PCR) sareng modifikasi na - PCR real-time. Ayeuna, sistem uji anu dikembangkeun ku panaliti Inggris (Cullen dkk, 2002) pikeun daérah ITS1 rDNA dianggo di Éropa sareng Amérika Serikat. Kagunaanna nunjukkeun hasil anu saé dina analisa isolasi Rusia (Belov et al, 2018). Nanging, coccodes C. variabel pisan sareng deteksi na tina sekuen DNA tunggal tiasa ngakibatkeun hasil négatip palsu. Kanggo diagnosis anu langkung dipercaya, perlu dianalisis sababaraha sekuen DNA spésifik-spésifik, anu pakait sareng anu kami parantos ngembangkeun sistem tés anu asli anu ngamungkinkeun ngaidentipikasi C. coccodes ku sekuen glyceraldehyde-3-fosfat dehidrogenase gén.
Bahan sareng métodeu
Pikeun meunteun efektivitas sareng kakhususan sistem tés anu diciptakeun, kami nganggo budaya murni tina 15 spésiés jamur anu diisolasi ku panulis tina sampel panyawat daun tomat sareng buah, umbi kentang (Tabel 1). Pikeun kapencilkeun, kami nyandak organ pepelakan kalayan gejala inféksi jamur, henteu langkung ti hiji organ per rungkun.
Sapotong umbi nganggo mesék, sapotong buah tomat, sareng daun anu ditaruh disimpen dina mikroskop binokular, satutasna miselium, spora, atanapi salembar jaringan dipindahkeun ka sedeng agar (wort agar) dina piring Petri kalayan jarum anu dibedah. Isolat disimpen dina miring agar dina tabung uji dina 4 ° C.
Sampel daun tomat kalayan gejala panyakit jamur, ditujukeun pikeun dianalisis, langsung saatos dikoléksi (di lapangan) disimpen dina 70% étil alkohol tempat disimpen dugi ka diasingkeun DNA. Ubi kentang dikirimkeun ka laboratorium, dikupas (2 × 1 cm sapotong) ti éta, sareng beku di -20 ° C. Disimpen beku dugi ka ngasingkeun DNA.
Budaya murni tina jamur pikeun ngasingkeun DNA dipelak dina medium kacang polong cair. Miselium tina jamur dikaluarkeun tina médium cair, garing dina kertas saring, beku dina nitrogén cair, homogenisasi, diinkubasi dina panyangga CTAB, dimurnikeun ku kloroform, diendapan ku campuran isopropanol sareng 0.5 M kalium asétat, dikumbah dua kali ku alkohol 2%. DNA anu dihasilkeun dibubarkeun dina cai anu didéioniskeun sareng disimpen dina -70 ° (Kutuzova dkk, 20). Konsentrasi DNA diukur nganggo kit kuantifikasi DNA HS pikeun DNA terdampar dua kali dina Qubit 2017 (Qiagen, Jérman). Sampel alkohol sareng beku anu triturated dina nitrogén cair, dituturkeun ku isolasi DNA sakumaha ditétélakeun di luhur (pikeun miselium budaya jamur murni).
Tabel 1. Asalna tina galur jamur anu dianggo
Ngaran supa | Tutuwuhan, organ | Tempat pamilihan |
---|---|---|
Konkét colletotrichum 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | umbi kentang | Daérah Kostroma, umbi kentang tina generasi ka-1, kultivar Beureum Scarlett |
Kodeu koléptotrichum 4 | daun kentang | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | umbi kentang | Daérah Magadan, pos. Tenda, umbi kentang |
Cladosporium fulvum | daun tomat | Daérah Moskwa, tomat buah-buahan |
Alternaria tomatophila | buah tomat | dikintunkeun ku staf laboratorium mycology sareng fitopatologi All-Russia Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | buah tomat | Téritori Krasnodar, kabupatén Krymsky, krim tingkat |
Fusarium oxysporum | akar gandum | Daérah Moskow |
PCR dilaksanakeun dina panguat DTprime (DNA-Technology). Pikeun PCR, primér aslina sareng usik pikeun daérah spésifik spésiés glikérol trifosfat gén dehidrogenase dianggo: maju primér Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, sabalikna Primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Primer nguatkeun daérah 213 bp.
Réaksi na nyandak 50 ng total DNA (dina analisa daun sareng umbi) sareng 10 ng (dina analisis DNA budaya murni tina jamur). Campuran réaksi (35 μl) dipisahkeun ku lapisan paraffin kana dua bagian: anu handap (20 μl) ngandung 2 μl tina buffer réaksi 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Antara- 20), 0.5 mM unggal trifosfat deoxynucleotide, 7 pmol unggal primér, sareng 4 pmol usik fluoresensi hidrolisis; anu luhurna ngandung 1 μl 10 × PCR panyangga sareng 1 U Taq polimérase.
Pamisahan campuran sareng parafin ngamungkinkeun tabung disimpen lami dina suhu 5 ° C sareng nyayogikeun awal anu panas pikeun PCR saatos manaskeun 10 menit dina suhu di luhur 80 ° C. PCR dilakukeun numutkeun program ieu: 94.0 ° C - 90 s (1 siklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 siklus); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 siklus); 10.0 ° C - ingetan.
Hasil sareng diskusi
Urutan gécerol trifosfat dehidrogenase ditangtukeun dina 45 galur anu diisolasi tina daun, batang, umbi kentang, sareng buah tomat (Kutuzova, 2018) di daérah anu béda-béda di Rusia. Urutan anu diulik pikeun sadaya galur dibagi kana 2 kelompok anu béda dina dua nukléotida. Runut nukléotida wawakil kadua kelompok dina nomer KY496634 sareng KY496635 disimpen dina GenBank.
Primer coc70gdf, coc280gdr sareng cocgdz usik anu dirancang dumasar kana dasarna diparios nganggo program BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) dina sadaya urutan glikérol trifosfat dehidrogenase spésiés tina genus Colletotrichum sareng organisme sanés anu aya dina basis data GenBank.
Henteu aya daérah DNA organisme sanés anu homologér pikeun primér sareng usik anu dipendakan.
Sensitipitas sistem tés dipariksa ngagunakeun sampel anu béda-béda konsentrasi C. coccodes DNA, DNA tina daun kentang anu katépaan antraknosa (dikumpulkeun taun 2017 di Mari El, ragam Beureum Scarlett), sareng mesék umbi anu kapangaruhan ku titik hideung (dikumpulkeun di daérah Kostroma, rupa-rupa Beureum Scarlett, Tabel 2). Pikeun mastikeun ayana DNA dina umbi sareng daun kentang, galur C. coccodes diisolasi ti aranjeunna kana budaya murni.
Hasil analisis sensitipitas sistem tés nunjukkeun yén éta tiasa dianggo pikeun hasil ngaagnosa ayana C. coccodes DNA dina sampel upami total eusi dina campuran PCR langkung ti 0.05 ng. Ieu cekap cekap pikeun deteksi, kumargi hiji sclerotia ngandung, rata-rata, 0.131 ng, sareng hiji spora ngandung sakitar 0.04 ng DNA (Cullen dkk, 2002). Sistem tés anu dikembangkeun ku grup Inggris (Cullen et al., 2002) nunjukkeun sénsitip anu sami (siklus ambang 34 dina 0.05 ng DNA sareng 37 di 0.005 ng).
Analisis sampel alami anu ngandung C. coccodes dina sadaya kasus dimungkinkeun pikeun dipercaya ngungkabkeun ayana dina sampel (Tabel 2). Metode anu diusulkeun pikeun ngasingkeun DNA ogé lumaku pikeun analisis sampel pepelakan alami.
Tabel 2. Tekad tina sensitipitas sistem uji anu diusulkeun pikeun idéntifikasi koccode Colletotrichum pikeun PCR sacara real-time
Образец | Jumlah DNA dina sampel *, ng | Siklus ambang | C. deteksi coccodes |
---|---|---|---|
Métroelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Kulit uyah 1 | 50 | 32 | + |
Kulit uyah 2 | 50 | 30 | + |
Kulit uyah 3 | 50 | 31.5 | + |
Daun kentang | 50 | 29.5 | + |
Catetan. * Dina campuran produk PCR.
Kekhususan sistem uji dipariksa kana sampel DNA anu sasari tina 15 spésiés jamur. Sadaya galur jamur diisolasi ku panulis tina buah-buahan anu kapangaruhan sareng séhat sareng daun tomat, umbi kentang; hiji galur diisolasi tina akar gandum (Tabel 1). Diantara anu diisolasi tina permukaan buah, aya ogé spésiés anu henteu patogén kanggo tomat (contona, Phellinus ferrugineovelutinus).
Panilitian parantos nunjukkeun yén C. coccodes DNA dideteksi dina siklus ambang 20-27, sedengkeun spésiés jamur anu sanés henteu dideteksi atanapi masihan sinyal saatos siklus 40, anu tiasa disababkeun ku pangaruh noise anu teu spésifik (Tabel 3).
Tabel 3. Nguji sistem tés pikeun sababaraha jinis supa
Ngaran supa | Siklus ambang |
Konci kolétotrichum 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatphila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineoveltinus | > 40 |
Vesicarium Stemphylium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium NS. | > 40 |
Catetan. * Jumlah DNA dina sadaya sampel nyaéta 10 ng.
Sistem uji anu dikembangkeun dianggo pikeun ngaidéntifikasi C. coccodes dina sampel daun tomat kalayan gejala patogén nekrotrofik sareng umbi kentang siki tanpa gejala anu katingali. Pikeun panilitian, kami nyandak umbi-umbi cikal tina sababaraha jinis anu dipelak di daérah Kostroma, Moskow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Ayana C. coccodes DNA dianggap dipercaya dina sampel, dina analisa siklus ambang teu langkung ti 35. Nilai ambang ieu dipilih dumasar kana tékad dipercaya 0.05 ng C. coccodes DNA (siklus ambang 33.5, Tabel 2) sareng kanyataan yén dina siklus bangbarung di luhur 40, DNA anu teu spésifik tina sababaraha spésiés jamur sanés didiagnosa. Kalayan pendekatan ieu, ayana signifikan C. coccodes DNA kauninga dina 5 sampel tubers anu dipelak di Kostroma, Moscow, daérah Kaluga sareng dina hiji daun tomat ti daérah Yeisk daérah Krasnodar (Tabél 4, 5).
Tabel 4. Detéksi koccode Colletotrichum dina umbi kentang *
Jumlah sampel | Kentang rupa-rupa | Tempat tumuh | C. deteksi coccodes | Siklus ambang |
---|---|---|---|---|
1 | Scarlet Beureum | Daérah Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Daérah Moskow | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky mimiti | Daérah Moskow | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Diolek | Daérah Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Implengan | Daérah Kaluga | - | |
15 | Gala | Wewengkon Nizhny Novgorod | - | |
16 | - |
Catetan. * Jumlah DNA dina sadaya sampel nyaéta 50 ng.
Tabel 5. Detéksi koccode Colletotrichum dina daun tomat *
Jumlah sampel | Tempat tumuh | C. deteksi coccodes | Siklus ambang |
---|---|---|---|
1 | Téritori Krasnodar, Kabupatén Krimea | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Daérah Krasnodar, kabupaten Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Jumlah DNA dina sadaya sampel 50 ng.
Sistem uji anu diciptakeun ku kami henteu kalah ka anu dimekarkeun ku panaliti Inggris (Cullen dkk, 2002) dina sensitipitas sareng spésifisitas sareng cocog pikeun analisis sampel tutuwuhan. Aplikasi na pikeun analisa umbi siki dimungkinkeun pikeun ngaidentipikasi C. coccodes DNA dina umbi tanpa tanda éksternal karuksakan sareng hasil nganalisis inféksi daun.
Dugi ka ayeuna, teu aya analisa umbi kentang pikeun panyawat C. coccodes parantos dilaksanakeun di Rusia. Panilitian munggaran urang nunjukkeun yén tina 16 tubers siki anu diuji dipelak di daérah anu béda-béda Féderasi Rusia, 5 ngandung C. coccodes. Ieu nunjukkeun yén titik hideung tina umbi kentang mangrupikeun panyakit kentang umum di Rusia, sareng peranna dina ngirangan volume sareng kualitas pepelakan kentang diremehkeun.
Analisis daun tomat ngungkabkeun ayana signifikan C. coccodes DNA dina hiji daun ti kabupaten Yeisk Téritori Krasnodar. Sateuacanna, nalika nalungtik sawah tomat di beulah kidul Rusia nganggo sistem uji Inggris (Cullen dkk, 2002), daun anu ngandung C. coccode dipendakan, sareng dina sababaraha lapangan seueur proporsi daun anu katépaan ku C. coccodes (Belov dkk., 2018). Di Téritori Krasnodar sareng Primorsky, Wewengkon Moskow, kami mendakan buah tomat, ti mana kami ngatur ngasingkeun budaya murni tina coccodes C. Tiasa waé C. coccodes langkung nyebar dina tomat di Rusia tibatan anu ayeuna dipercaya, sareng bahaya na ogé diremehkeun.
Janten, dugi ka ayeuna, cekap inpormasi parantos akumulasi ngeunaan sebaran lega C. coccodes kana kentang sareng tomat.
Pikeun langkung ngartos peran jamur ieu dina ngembangkeun panyakit kentang sareng tomat, perlu dipantau kasebaranana di Rusia, diajar peran inféksi taneuh sareng siki, sareng peran titik hideung dina karugian nalika disimpen. Pamakéan diagnostik PCR sacara signifikan tiasa mempermudah padamelan ieu, sareng panggunaan sakaligus ti kadua sistem uji sacara signifikan bakal ningkatkeun akurasi analisis.
Karya ieu dirojong ku hibah Yayasan Élmu Rusia no. 18-76-00009.
Tulisan ieu diterbitkeun dina jurnal "Mycology and Phytopathology" (jilid 54, No. 1, 2020).